1927年7月，惲代英被中共臨時中央派赴九江，后轉赴南昌。7月24日，中共中央在武漢召開臨時中央常委會，惲代英與周恩來、李立三、彭湃、譚平山等5人組成起義前敵委員會，分析敵我形勢，確定起義的時間、地點、起義部隊、組織機構、行動計劃和作戰部署。

　　南昌起義爆發前，張國燾趕到九江傳達所謂“國際來電”，企圖阻止起義，遭到惲代英等的強烈反對，惲代英主張必須依靠共產黨人已經確定的武裝力量，進行獨立軍事行動，并憤怒地對張國燾說：“現在南昌一切準備好了，忽然又來了什么國際指示，阻止我們的行動，我是誓死反對的。”“如果你再動搖人心，就要打倒你。”

　　南昌起義勝利后，惲代英任革命委員會委員、主席團委員及代理宣傳委員會主任。8月1日，在惲代英的布置下，《宣傳大綱》以及重要的標語口號已散發到各處，負責演講做群眾工作的宣傳隊，已深入到南昌城內的大街小巷，系著紅領巾的起義軍巡邏隊步伐威武地在熱鬧的市區巡邏。

　　8月2日，惲代英在南昌市組織了5萬人參加的“慶祝革命委員會成立和軍民聯歡大會”，并在會上慷慨陳詞，闡述了“為了挽救革命，反對國民黨大屠殺的武裝起義的總方針”，“斗志昂揚地鼓勵士兵和群眾，為推翻國民黨的反革命統治，捍衛工農階級的利益，建立革命政權，必須緊緊地把槍桿子握在手中。”

　　南昌起義勝利后，起義軍按原計劃撤離南昌開始南征。惲代英忙著做政治思想教育和宣傳工作，“每到行軍休息時，他總是和戰士們一起，給戰士們做思想工作，宣傳革命必勝，鼓動戰士們英勇奮戰。”面對南征途中各種困難，惲代英從未說一聲勞累困苦，并且還經常鼓勵戰士們：“革命本非享福與畏難的人干的事。”行軍途中，他引導戰士們齊聲高唱，解除行軍疲勞。惲代英與士兵同甘共苦，用自己的行動感染大家，提升戰士的革命激情。惲代英身患肺病，組織上照顧配給他一匹馬，但他總是把馬讓給有病的或體弱的同志騎，自己穿著一套粗布軍衣，扛著背包，肩上搭著一條長布手巾，與戰士們一起步行。

　　起義軍在撫州、廣昌、瑞金、長汀、上杭、汕頭等停留時間較長的城市里，都組織群眾集會，每次都有惲代英講話。他向渴求解放的群眾分析國內外政治形勢，解釋革命軍的目的和政策。惲代英的講話通俗易懂，使群眾很容易接受。